除了通过测序鉴定出肿瘤组织内存在细菌，还有其他哪些方法可以证明肿瘤内存在细菌（最好是可视化的，眼见为实嘛），又有哪些方法能证实肿瘤内存在活菌。以下就来介绍几种文献中常用到的方法（从易到难）。
1. 免疫组织化学（ImmunoHistoChemistry, IHC）
免疫组织化学（简称免疫组化）是利用抗体和抗原之间的结合具有高度特异性的原理，先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体（可直接购买商业化的抗体），再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来。此方法不仅可以用来检测抗原的表达量也可观察抗原所在位置，是一种定性、定位、定量测定的技术。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可检测。
IHC实验的简要过程：首先固定样本，以保留细胞完整性，之后与封闭液共同孵育，避免抗体的非特异结合。随后将样本先后与一抗和二抗孵育，再进行显色，复染，封片，最后通过显微镜分析观察信号。
用IHC检测组织中的细菌，用抗细菌脂多糖(LPS)和脂磷壁酸(LTA)的抗体分别检测革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌（图1）[1,2]。
图1 用抗LPS和LTA的抗体分别检测肿瘤组织内革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌
2. 荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）FISH是基于核酸碱基互补配对原则，同源的DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA两条核酸单链，在一定条件下结合成双链。荧光素直接标记的核酸探针及靶DNA或RNA，两者混合杂交，互补形成杂交体，最后通过荧光显微镜进行观察，从而实现对靶DNA或RNA的定性、定量和定位分析（图2）。
图2 FISH检测原理
FISH简要的实验过程:探针变性、标本变性、杂交、洗脱、杂交信号放大(生物素标记的探针)、复染、封片、荧光显微镜观察FISH结果。
用FISH检测组织中的细菌DNA或RNA，用针对细菌16S rRNA基因的探针进行检测（图3）[3]。
图3 用16S rRNA探针检测肿瘤组织内16S rRNA
3. 荧光标记的D-丙氨酸原位标记活菌（Live in-situ bacteria labeling with fluorescent D-alanine）为什么D-丙氨酸可以用来标记活菌？这是因为D-丙氨酸会被细菌用来生产细胞壁的重要成分肽聚糖，而哺乳动物细胞没有细胞壁，不会使用D-丙氨酸[4]。
要在肿瘤中证实存在具有代谢活性的活细菌，可以通过体外培养新鲜切除的肿瘤切片时，加入荧光标记的D-丙氨酸。若肿瘤中检测出D-丙氨酸的荧光信号，则可以说明肿瘤中含有活的细菌(图4)。
图4 用荧光标记的D-丙氨酸（蓝色）体外培养肿瘤切片。细胞核用DRAQ5染色（橙色）。
4. 培养组学（Culturomics）
培养组学的基本思路是采用多种培养条件得到菌落，利用MALDI-TOF质谱和16S rRNA基因测序鉴定细菌种属（图5）[5]。随着宏基因组学方法（如16S测序和宏基因组测序）的发展，其基本思想是跳过传统的微生物分离培养，而把微生物群落当做整体来做研究，这使得对微生物的纯培养逐渐被忽视，然而这些方法不能提供微生物的纯培养物，而纯培养物对进一步研究菌株特性、体外模型和宿主感染又是必需的（知识回顾>>证明肠道菌群与疾病的因果关系，你需要遵守“科赫法则”| 微生物专题）。培养组学技术可以分离得到大量可培养的微生物，发现潜在的新菌种，丰富现有的可培养微生物资源库，并和宏基因组学技术形成互补。
图5 培养组学实验流程图
通过培养组学技术获取肿瘤组织中活菌的简要过程：采集新鲜的肿瘤组织，在无菌条件下温和地解离，然后接种在数十种不同类型的琼脂生长培养基上，并在好氧和厌氧条件下培养，这代表广泛的生长条件，以适应高度多样性的细菌[6]。再利用MALDI-TOF质谱和16S rRNA基因测序（或宏基因组测序）对分离培养得到的代表性菌落进行菌种鉴定。
更多细节请查看军科院杨瑞馥、毕玉晶等撰写的《培养组学方法优化》（点击查看）
拓展阅读：
1. Raetz CR, Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev Biochem. 2002;71:635-700.2. Fischer W. Lipoteichoic acids and lipoglycans. In: Ghuysen JM, Hakenbeck R (eds) Bacterial cell wall. New comprehensive biochemistry. 1994; 27:199-215.3. Amann RI, Binder BJ, Olson RJ, Chisholm SW, Devereux R, Stahl DA. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl Environ Microbiol. 1990 Jun;56(6):1919-25.4. Siegrist MS, Whiteside S, Jewett JC, Aditham A, Cava F, Bertozzi CR. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 2013 Mar 15;8(3):500-5.5. Lagier JC, Dubourg G, Million M, Cadoret F, Bilen M, Fenollar F, Levasseur A, Rolain JM, Fournier PE, Raoult D. Culturing the human microbiota and culturomics. Nat Rev Microbiol. 2018 May 1;16:540-550.6. Lau JT, Whelan FJ, Herath I, Lee CH, Collins SM, Bercik P, Surette MG. Capturing the diversity of the human gut microbiota through culture-enriched molecular profiling. Genome Med. 2016 Jul 1;8(1):72.
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